Hijo de un profesor de química-física de la Universidad, nació en Viena. Estudió en Munich y obtuvo el doctorado en 1921. Con solo 20 años escribió un artículo enciclopédico de más de doscientas páginas sobre la teoría de la relatividad, texto admirado por Einstein, quien atribuyó al joven autor "una honda penetración en los problemas de la física". En los años siguientes continuó estudios junto a Niels Bohr, en Copenhague y a Max Born en Gotinga.
Nombrado profesor en la Universidad de Hamburgo, en 1924 propuso un cuarto número cuántico, necesario para poder especificar los estados energéticos del electrón. (Posteriormente se verificó la existencia de estos números cuánticos, denominados de "espín", representativos de las dos direcciones posibles de giro sobre el eje de rotación de los fermiones). En 1925 introdujo el principio de exclusión, que clarificó de forma inmediata la estructuración de los átomos en la tabla periódica. En 1928 ingresó en el Instituto Federal de Tecnología de Zurich como profesor de física teórica; bajo su dirección, esta institución se convirtió en uno de los más importantes centros de investigación de Europa.
Hacia 1929 observó que cuando se emite una partícula beta (electrón) desde un núcleo atómico, por lo general se produce una pérdida de energía, lo cual constituye una flagrante violación de la ley de conservación de la energía. Para explicar el fenómeno propuso en 1931 la existencia de alguna partícula llamada luego neutrino por Enrico Fermi eléctricamente neutra y de masa nula o casi inapreciable, cuya desaparición pasa inadvertida, ya que interactúa con la materia de forma muy débil. (El neutrino fue detectado como entidad en 1956).
Viajó a Estados Unidos en 1940 para hacerse cargo de la cátedra de física teórica del Instituto de Estudios Avanzados de la Universidad de Princeton. En 1946 obtuvo la nacionalidad estadounidense. Cuando finalizó la segunda guerra mundial regresó a Zurich y continuó trabajando; allí falleció. Sus biógrafos consignan: "Pauli poseía un cáustico sentido del humor, sus clases magistrales no eran demasiado buenas, y tampoco destacó como experimentador. Sin embargo, es uno de los gigantes de la física teórica del siglo XX".
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